La necesidad de controlar la pandemia causada por el SARS-CoV-2 ha llevado a investigadores de todo el mundo a desarrollar técnicas que permitieran una anticipación a los posibles contagios que se seguían produciendo a pesar de las medidas adoptadas en todos los países del mundo.
Entre las técnicas más utilizadas para la detección del SARS-CoV-2 se encuentra la RT-qPCR. Esta técnica permite una detección rápida y fiable del virus en una gran variedad de muestras; nasal y/o faríngea en el caso de la detección individual y muestras de superficie, aire y agua para controles de espacios y poblaciones. En el caso de las muestras de agua, ha resultado especialmente interesante el estudio del agua residual por la peculiaridad de que puede detectarse la presencia del virus incluso antes de que se produzcan síntomas en la población, sirviendo está técnica como un analizador temprano de la situación.
Pero la verdad es que, en los laboratorios especializados en el análisis de aguas, ya se utilizaba la técnica de la PCR para la detección de microorganismos mucho antes de la pandemia del COVID.
“Puede detectarse la presencia del virus incluso antes de que se produzcan síntomas en la población, sirviendo esta técnica como un analizador temprano de la situación”
Aplicaciones de la técnica q-PCR en aguas, al margen del SARS-CoV-2
Uno de los análisis más habituales en los laboratorios medioambientales es el de las torres de refrigeración. En este tipo de infraestructuras, el ambiente húmedo y las altas temperaturas favorecen el crecimiento de algunos microorganismos. Entre los que más preocupan se encuentran las legionelas (Legionella spp., siendo la más común Legionella pneumophila) que, si se inhalan, pueden provocar legioneliosis, una enfermedad bacteriana con dos manifestaciones clínicas en humanos:
- la fiebre de Pontiac y
- la enfermedad del legionario (caracterizada por síntomas respiratorios graves, incluida la neumonía).
Con el fin de evitar esta enfermedad, las empresas se comprometen a llevar a cabo una correcta inspección, limpieza y desinfección de las torres.
“El recuento de células totales (viables y no viables) puede resultar de interés en algunas ocasiones pero, para el control oficial de muestras de legionelas en aguas, se necesitan métodos que incluyan recuento únicamente de células vivas“
Después de un diagnóstico positivo de crecimiento de legionelas en una torre de refrigeración, se procede a la desinfección de la infraestructura y, posteriormente, se vuelve a realizar un análisis de qPCR para comprobar la eficacia de la desinfección. En estos casos pueden llevarse a cabo dos análisis independientes y complementarios. Por un lado, se realiza una qPCR posterior a la desinfección, que nos indica la cantidad de legionelas totales que todavía están presentes en las aguas de la torre. El recuento de células totales (viables y no viables) puede resultar de interés en algunas ocasiones pero, para el control oficial de muestras de legionelas en aguas, se necesitan métodos que incluyan recuento únicamente de células vivas.
Los análisis de legionela por qPCR son una herramienta perfecta para el control cuantitativo de este tipo de bacterias porque además de ahorrar tiempo en el cultivo de las placas, la fiabilidad de la técnica es mucho más alta debido a que estos microorganismos pueden mantenerse en un estado viable pero no cultivable por varios motivos, por lo que podrían obtenerse falsos negativos en los cultivos en placa.
Por tanto, en caso de que aún obtengamos un resultado positivo en el análisis de células totales, se puede realizar una RT-qPCR de RNA de tal forma que podemos distinguir si las legionelas obtenidas en el primer análisis son viables (capaces de multiplicarse y dar lugar a una colonia) o no. En caso de que el resultado de la RT-qPCR de legionelas viables de negativo, esto es indicativo de que el proceso de desinfección ha funcionado correctamente.
” La fiabilidad de la técnica es mucho más alta debido a que estos microorganismos pueden mantenerse en un estado viable pero no cultivable por varios motivos, por lo que podrían obtenerse falsos negativos en los cultivos en placa”
El análisis de viables
Según A. Baumgartner y colaboradores en su artículo Rapid detection of viable Legionella pneumophila in tap water by a qPCR and RT-PCR-based method, publicado en el Journal of Applied Microbiology, el análisis de viables mediante biología molecular puede llevarse a cabo con la amplificación de dos regiones indicativas de la actividad celular;
- por un lado, la amplificación de una región específica del RNA mensajero. Este tipo de material genético es degradado por la propia célula al poco de realizar su función en el citoplasma, por lo que la detección de este RNA es indicativo de que la célula tiene actividad y por tanto es viable.
- Actualmente, se está optando más por la detección del precursor del RNA ribosómico 16S. El precursor del RNA ribosómico se sintetiza en las bacterias en crecimiento y es específico de cada especie. Durante la maduración del RNA ribosómico, estas secuencias precursoras se eliminan para dar lugar al RNA ribosómico maduro, por lo que, la detección de este precursor también es indicativo de actividad en la célula y por tanto de su viabilidad.
La ventaja de este RNA ribosómico frente al mensajero es su mayor estabilidad, su facilidad para detectarse y una manipulación más sencilla, por lo que en la actualidad esta diana suele ser la elegida para el análisis de viables mediante PCR.
Este tipo de recuento de microorganismos totales y viables resulta extremadamente útil no solo en el caso de las legionelas de las torres de refrigeración, si no para cualquier proceso del que queramos estar seguros de que, aunque puedan quedar restos del material genético del microorganismo y por tanto veamos amplificación en la PCR, estos microorganismos no serán capaces de replicarse o de resultar infectivos para provocar una enfermedad.
En conclusión
Las posibilidades de detección de microorganismos por medio de la biología molecular en la actualidad son amplísimas. Los avances realizados en este campo en los últimos años han permitido que se pueda detectar prácticamente cualquier microorganismo en casi cualquier tipo de muestra, lo que supone una mejora sustancial tanto en el tiempo de procesado como en la fiabilidad de la técnica si comparamos estos análisis con los análisis clásicos de microbiología.
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Bibliografía
Rapid detection of viable Legionella pneumophila in tap water by a qPCR and RT-PCR-based method, R. Boss,A. Baumgartner,S. Kroos,M. Blattner,R. Fretz,D. Moor, publicado en el Journal of Applied Microbiology.
SARS-CoV-2 in the environment: Modes of transmission, early detection and potential role of pollutions, Khaled Al Huraimel, Mohamed Alhosani, Shabana Kunhabdulla, and Mohammed Hashem Stietiva.
