Errores de Concepto sobre la qPCR

La pandemia del COVID ha acercado la PCR tanto a los usuarios, que hasta nuestros padres se permiten ahora discutirnos los resultados de sus y nuestras pruebas, y enarbolan el criterio de su enfermera o de lo que dice la prensa como si un Juez hubiera dictado sentencia.

Pasados ya los peores momentos, y ahora que la emergencia informativa no es tal, volvemos a enfocar nuestro interés en otras tecnologías; en las convencionales, y un poco también en las que siguen siendo las promesas de desarrollo del IVD en los próximos años.

Con menos foco informativo y con más tranquilidad, en Akralab hemos pensado, que sería interesante aportar algo de Ciencia para el buen entendimiento de profesionales, clientes, usuarios y beneficiarios de la PCR en general.

Se han dicho muchas barbaridades, los usuarios se han vinculado a conceptos de manera perversa, y parecen haberse asentado errores de bulto que entre todos debemos ayudar a desvelar.

Hablaremos en varias ocasiones del Ct y de esa curva sigmoidal que se han convertido en “icono pop” de la pandemia, y que son el centro de muchos errores de concepto.

Hagamos una pequeña lista de preconceptos, falsedades de algunos fabricantes y demás:

1. La qPCR en pandemia no ha sido una PCR cuantitativa

La PCR de tiempo real o cuantitativa permite frente a la PCR convencional o de tiempo final, estimar las copias de un gen o genes del SARS-CoV-2 presentes en la muestra gracias a que hay una señal de fluorescencia ligada a la muestra inicial, y esta señal es medible por el detector del equipo. No obstante, para cuantificar el número de copias o la carga viral, es imprescindible una recta de calibrado realizada con una muestra patrón y diluciones. En muy escasas ocasiones la Sanidad española (privada y pública) ha hecho una recta patrón.

Podríamos decir que en pandemia se ha hecho una lectura estimativa de la carga vírica en un paciente, una medida “semi-cuantitativa” con vistas a aislar pacientes potencialmente infecciosos.

2. El Ct no es indicador absoluto de Carga Viral

De nuevo, esto ha sido una gran mentira.  En cada comunidad se ha establecido un punto de corte para decidir si un paciente era PCR positivo o negativo. En la comunidad valenciana se ha considerado como positivo un ct por debajo del ct35, y en Madrid solo es positivo por debajo del 30. El Ct no es un término absoluto de carga viral ni tampoco lo es el tiempo al cabo del cual aparece el Ct (ciclo en el que la curva supera el umbral).

En puridad, cualquier Ct, aunque aparezca al cabo de dos horas, sería indicativo de presencia de genes víricos, puesto que un Ct por definición implica una señal apreciable por encima de la línea base; esto es una fluorescencia por encima del ruido de fondo, y por tanto identificadora de presencia de copia/s del gen de interés, en este caso de SARS-CoV-2.

Otra caso es el criterio de cada Sanidad Regional para decidir el punto de corte para informar de un positivo.

3. Todos las marcas y modelos de qPCR han de dar el mismo valor de Ct para una misma muestra

Imposible. El tiempo y manera en que puede aparecer el Ciclo Umbral o Ct depende de múltiples factores, como son el protocolo de extracción de los ácidos nucleicos, la MasterMix de nuestro kit, la óptica del termociclador, etcétera. No es lo mismo una extracción de ARN con kit de perlas magnéticas que una qPCR directa con un mero tampón de lisis. No es lo mismo una qPCR de POCT que da resultados en 25 minutos que una qPCR en termociclador convencional de hora y media.

Desgraciadamente esta es la realidad, y lamentamos que los clientes con variedad de equipos de qPCR en un laboratorio hayan tenido que afrontar esta verdad científica porque reconocemos que rompe su protocolo de actuación. Se puede, y de hecho todos hemos tenido que hacerlo, “forzar” el protocolo de los instrumentos para que las gráficas mostraran Cts parecidos, pero esto no deja de ser una patraña metodológica, y un sinsentido científico. El PNT correcto del laboratorio debiera establecer un criterio de diagnóstico según el instrumento empleado. Esta sí es la realidad.

4. Los equipos de amplificación por método LAMP también aportan valores de Ct

Que buenas son algunas empresas, sobre todo las grandes multinacionales del sector IVD en maquillar las realidades de las que parten y solventar con Marketing sus carencias de producto. Hay un gran fabricante de marca prestigiosa que ha aportado muchos equipos de POCT al mercado durante la pandemia para hacer diagnóstico COVID. La técnica elegida sin embargo no pudo ser qPCR pero eligieron la amplificación isoterma o LAMP.

Esta técnica, de manera inherente, no puede dar un valor de Ct básicamente porque trabaja de otra manera, y el concepto Ct le es ajeno. Es como hablar de cuantos electron-voltios te da tu ecógrafo, o de qué valor de Absorbancia te ha dado tu balanza analítica.

Pues bien, por algoritmos mágicos esta marca de amplificación LAMP da gráficamente Cts,  ¿Gracioso verdad? ¿Con qué fin? Con el de parecerse a los equipos de qPCR de la competencia a los que tendría que enfrentarse y compararse. Intentar forzar las gráficas y resultados de un termociclador de qPCR para que muestre Cts parecidos al pastiche de Ct que produce un equipo LAMP provoca hilaridad.

5. Si el Test de Antígeno da postivo y la qPCR negativa, la PCR está mal

No es así. Especialmente cuando el paciente está ya saliendo de la enfermedad es posible que no haya carga vírica reseñable, que es lo que detecta la PCR, pero en la mucosa nasal pueden quedar restos de proteínas de la cápside del virus muerto, que es al fin y al cabo lo que detecta un test rápido.

En conclusión, la qPCR, se ha democratizado como técnica y ha llegado a todo tipo de laboratorios, se ha convertido en otra instrumentación genérica en los mismos, por desgracia debido a esta pandemia. Le vaticinamos aún un gran recorrido, puesto que hay muchas técnicas que añadir a las plataformas instaladas, y cuando el COVID acabe habrá que amortizarlas con nuevos patógenos o diagnósticos.

Todo lo que aterriza de manera tan sorpresiva e inesperada tarda en ser digerido, y muy posiblemente en breve al frente de cada Unidad de PCR habrá expertos capaces de discriminar las verdades científicas de las medias verdades y de los mensajes comerciales engañosos.