La llegada de la pandemia de COVID-19 ha impulsado de una forma sin precedentes a la técnica RT-qPCR, que desde un primer momento se convirtió en el estándar de diagnóstico para este virus. Esto ha ocasionado una rápida necesidad de optimizar los flujos de trabajo para mejorar el rendimiento del proceso. En este post, explicamos como abordar esta optimización, así como sus límites.
Desde el inicio el estado de alarma en marzo del año pasado los laboratorios de biología molecular de nuestro país, tanto públicos como privados, han hecho un gran esfuerzo por sacar adelante multitud de peticiones de diagnóstico COVID mediante el uso de la técnica RT-qPCR.
La RT-qPCR, orientada a la detección semicuantitativa de los ácidos nucleicos del SARS-CoV-2, ha pasado de ser una técnica prácticamente desconocida a ser una técnica rutinaria en una gran cantidad de laboratorios tanto clínicos como hospitalarios. Esta normalización e inclusión en las rutinas diarias de trabajo ha producido una rápida optimización en los flujos de trabajo, que se han ido adaptando a cada laboratorio con ciertas particularidades. Aunque en algunas ocasiones los abordajes de optimización suponen una mejora en términos de productividad, entendida como el número de muestras procesadas por unidad de tiempo, la mayoría de ellos están orientados a producir una disminución en los costes de la técnica y, aunque este abaratamiento no tiene por qué estar reñido con una sensibilidad aceptable, puede llegar a ser peligroso si no se hace de forma adecuada.
En este contexto, las modificaciones en los protocolos de genotipado se podrían dividir en dos grandes categorías: (I) la optimización del número de pocillos ocupados y (II) la optimización del volumen de reacción.
(I) Optimización del número de pocillos ocupados
La agrupación de muestras o generación de pools es un procedimiento habitual asociado a un cribado poblacional. Se fundamenta en la generación de grupos ciegos en los que existe cierta probabilidad de encontrar un caso positivo. De esta manera son los grupos de muestras los que se analizan en cada pocillo de reacción, disminuyendo la cantidad de pocillos usados en función del tamaño de los grupos de muestras generados.
Dado que la generación de estos pools conlleva necesariamente la dilución de unas muestras con otras, surgen ciertas cuestiones en este proceso: ¿Hasta qué punto puedo diluir una muestra y no perder capacidad de detección? Además, cuantas más muestras contenga el pool mayor será la probabilidad de encontrar un caso positivo que me obligará a testar cada muestra de forma individual… ¿Hasta qué punto es rentable agrandar los pools?
Para resolver la primera cuestión es necesario establecer la siguiente premisa: durante una PCR el número de moléculas de ADN en un determinado ciclo térmico es el doble respecto al ciclo térmico anterior, es decir, en cada ciclo térmico de la PCR se duplica el número de moléculas de ADN que hubiere en el ciclo anterior. En base a esta premisa, cada vez que diluyamos una muestra a la mitad, la amplificación de algún producto de PCR se llevará a cabo con un ciclo térmico de diferencia.
Aumento del número de CTs al aumentar la dilución de las muestras.
Imaginemos que una muestra positiva para SARS-CoV-2 cuya PCR ha rendido un Ct de 34 para alguna de las dianas de la detección es diluida a razón 1:2. De forma teórica, la realización de una nueva PCR rendiría un Ct de 35 para esta misma diana. Si diluimos la muestra original a razón 1:4, la PCR pasaría a rendir un Ct de 36 para la misma diana, y así sucesivamente. A priori podríamos pensar que mientras aumentemos el número de ciclos térmicos en el programa de termociclado podríamos diluir las muestras de forma prácticamente indefinida. En la práctica esto no es realista ya que (1) alargaríamos los tiempos de termociclado de forma contraproducente y (2) el aumento de ciclos térmicos incrementa la probabilidad de amplificaciones específicas debido a mutaciones en ciclos anteriores y polimerización de cebadores.
Se recomiendan pools de máximo 8 muestras y su tamaño final deberá optimizarse en un determinado marco epidemiológico
Actualmente, los organismos oficiales están estableciendo un umbral límite en el ciclo térmico 35 para notificar los positivos, mientras que las especificaciones técnicas de los fabricantes suelen tomar el ciclo 40 como límite de detección, lo que nos da un margen de 5 Ct’s para “jugar”. Siguiendo con nuestra premisa, 5 ciclos térmicos sería la diferencia entre una muestra X y una muestra X diluida 25 veces, es decir, una muestra diluida 32 veces. Parece un gran margen de maniobra poder hacer pools de 32 muestras, aunque la realidad suele ser distinta a la teoría. La presencia de microrregiones, variaciones de pipeteo, eficiencias de reacción, etc. hacen que los valores de Ct obtenidos en cada PCR puedan variar sustancialmente a pesar de tratarse de réplicas técnicas. Son esperables diferencias de hasta 2 Ct’s en réplicas técnicas de la misma reacción, por lo que el número de ciclos térmicos que contamos como margen quedarían reducidos a 3 (pools de 23 (8) muestras). De forma empírica la mayoría de laboratorios han establecido grupos de entre 5 y 8 muestras como recurso para abaratar los costes del diagnóstico y para reducir cargas de trabajo.
En contrapartida, el número máximo de muestras que se aconseja agrupar bajo el riesgo de desglosar y pormenorizar dicho pool en el caso de contener algún caso positivo se determinaría en función de la incidencia de la enfermedad: una incidencia del 10% provocará que la gran mayoría de los pools de 10 muestras sean positivos, que cerca del 50% de los pools de 5 muestras sean positivos y así consecutivamente. Este factor de probabilidad podría considerarse como la probabilidad de repetición ya que obligará a analizar cada muestra de forma individual, que, de ocurrir de manera demasiado frecuente, podría llegar a ser contraproducente. En resumen, se recomiendan pools de máximo 8 muestras y su tamaño final deberá optimizarse en un determinado marco epidemiológico teniendo en cuenta los datos de incidencia.
Otro intento de reducir el número de pocillos usados en cada tanda de termociclado es la omisión de los controles positivos y/o negativos. Desde Akralab desaconsejamos encarecidamente este abordaje pues su coste/beneficio es altísimo. No detectar posibles problemas de contaminación (control negativo) o funcionamiento de reactivos y fluorescencias (control positivo) nos pueden llevar a errores sistemáticos en el diagnóstico y a la repetición extensiva de reacciones, con el gasto que ello conlleva. Para llevar a cabo esta aproximación suelen utilizarse termocicladores qPCR de alta capacidad.
(II) Optimización del volumen de reacción
Por último, tocando la optimización de los volúmenes de reacción, en Akralab somos tajantes con la reducción de los volúmenes de reacción. Los ensayos de sensibilidad y especificidad han sido llevados a cabo bajo ciertas constantes, siendo una de ellas el volumen de reacción.
La modificación de los volúmenes de reacción puede llevar a reducciones en las tasas de sensibilidad y especificidad
Puede ser tentador obtener un mayor número de reacciones reduciendo el volumen de ésta de 50 a 30 µL, por ejemplo. La modificación de los volúmenes de reacción puede llevar a reducciones en las tasas de sensibilidad y especificidad. Además, el uso de volúmenes de reacción diferentes a los especificados por los fabricantes les hará perder el respaldo legar otorgado por la certificación IVD, por lo que desde Akralab, volvemos a insistir. Es necesario respetar las condiciones de trabajo especificadas por el fabricante para una performance óptima de los reactivos.
En resumen, podemos decir que a lo largo de todos estos meses se han ido popularizando ciertas estrategias que han permitido agilizar y optimizar económicamente el diagnóstico de la COVID y que, bien planteadas y ejecutadas, han permitido mantener los estándares óptimos de detección en nuestros laboratorios.
Escrito por: Sergio Ibáñez, nuestro Especialista en Biología Molecular.
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